Seq-Well：一種便攜、低成本且高通量的單細(xì)胞RNA測(cè)序方法

對(duì)單細(xì)胞中的mRNA分子進(jìn)行測(cè)序，能夠揭示這些細(xì)胞在特定時(shí)間內(nèi)發(fā)生的事件。然而，這種分析所需的設(shè)備非常笨重并且不能廣泛獲得。

麻省理工學(xué)院（MIT）的研究人員如今開發(fā)了一種便攜式的技術(shù)，可以快速地從許多細(xì)胞中制備RNA并同時(shí)進(jìn)行測(cè)序，他們認(rèn)為這將使單細(xì)胞RNA測(cè)序方法得到更廣泛的使用。這項(xiàng)新技術(shù)被稱為Seq-Well，可以使科學(xué)家們更容易地識(shí)別組織樣本中的不同細(xì)胞類型，幫助他們研究免疫細(xì)胞如何對(duì)抗感染和癌細(xì)胞如何響應(yīng)治療等。

?MIT的助理教授Alex K. Shalek說，“它并不是通過挑選一個(gè)標(biāo)記物來定義一種細(xì)胞類型，使用單細(xì)胞RNA測(cè)序，我們可以觀察在特定時(shí)刻細(xì)胞中表達(dá)的一切。通過發(fā)現(xiàn)細(xì)胞之間的共同模式，我們可以了解這些細(xì)胞的類型。”

Shalek等人在過去幾年中已經(jīng)開發(fā)了多種單細(xì)胞RNA測(cè)序策略。在這項(xiàng)新研究中，他與MIT的副教授J. Christopher Love合作，創(chuàng)建了一個(gè)新版本的技術(shù)，可以使用非常簡(jiǎn)單的設(shè)備快速分析大量細(xì)胞。

Love說，“我們將之前開發(fā)的技術(shù)結(jié)合在一起，使研究人員能夠在一系列不同的臨床樣品和環(huán)境中進(jìn)行這種類型的測(cè)序，它克服一些障礙，可以使這些技術(shù)得到更廣泛的應(yīng)用。”

這項(xiàng)新技術(shù)于2月13日發(fā)表在《Nature Methods》上，Love和Shalek是其通訊作者。

快速分析

人體中的大多數(shù)細(xì)胞僅表達(dá)基因組中基因的一部分。這些基因的信息被復(fù)制到mRNA分子中，也稱為RNA轉(zhuǎn)錄物，指導(dǎo)細(xì)胞構(gòu)建特異性蛋白質(zhì)。每個(gè)細(xì)胞的基因表達(dá)譜根據(jù)其功能而變化。

對(duì)血液或組織樣本中的許多單細(xì)胞進(jìn)行RNA測(cè)序，提供了一種基于基因表達(dá)模式來區(qū)分細(xì)胞的方法。這使科學(xué)家能夠確定細(xì)胞的功能，包括它們?cè)诩膊』蛑委煼磻?yīng)中的作用。

測(cè)序大量細(xì)胞的關(guān)鍵是追蹤哪些RNA轉(zhuǎn)錄物來自哪個(gè)細(xì)胞。早的技術(shù)需要將細(xì)胞分選到多孔板上的單獨(dú)的管或隔室中，然后分別將每個(gè)細(xì)胞制備成測(cè)序文庫。

這個(gè)過程能夠順利進(jìn)行，但不能處理含有數(shù)千個(gè)細(xì)胞的大樣品，例如血液樣品或組織樣品，且每個(gè)細(xì)胞的成本在25美元到35美元之間。

Shalek等人近開發(fā)了微流體技術(shù)，以幫助實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化和并行化過程，但是所需設(shè)備的數(shù)量使其不容易運(yùn)輸。

Shalek和Love意識(shí)到，Love以前開發(fā)的用于分析單細(xì)胞蛋白質(zhì)分泌物的技術(shù)，可以使用便攜式設(shè)備，快速和低成本地進(jìn)行單細(xì)胞RNA測(cè)序。

Love的實(shí)驗(yàn)室開發(fā)的這個(gè)微型系統(tǒng)，可以分離單細(xì)胞，測(cè)量每個(gè)細(xì)胞分泌的抗體和其他蛋白質(zhì)。該設(shè)備類似于一個(gè)微小的冰塊托盤，將每個(gè)細(xì)胞置于一個(gè)隔室中。Love還開發(fā)了一個(gè)稱為微雕刻的過程，使用這些托盤，可以容納數(shù)萬個(gè)細(xì)胞，以測(cè)量每個(gè)細(xì)胞的蛋白質(zhì)分泌物。

為了使用這種方法測(cè)序RNA，研究人員創(chuàng)建了納米孔陣列，每個(gè)納米孔可捕獲一個(gè)單細(xì)胞和一個(gè)條形碼珠子，以進(jìn)一步捕獲RNA的片段。納米孔用半透膜密封，允許破壞細(xì)胞所需的化學(xué)物質(zhì)通過，而同時(shí)保證RNA不流失。RNA結(jié)合珠子后被移除并進(jìn)行測(cè)序。使用該過程每個(gè)細(xì)胞的成本小于1美元。

?Seq-Well 的工作流程。

揭露未知

與以前的單細(xì)胞RNA測(cè)序技術(shù)類似，Seq-Well技術(shù)能夠捕獲和分析每個(gè)細(xì)胞RNA轉(zhuǎn)錄物總數(shù)的10%~15%。

Love說，“這包含了映射到數(shù)千個(gè)基因的豐富信息。關(guān)注這些基因的集合，就可以通過其共同的表達(dá)來鑒定細(xì)胞的類型。”

在該文章中，研究人員使用Seq-Well來分析被稱為巨噬細(xì)胞的免疫細(xì)胞，其被結(jié)核病感染。他們鑒定出了不同的人群和對(duì)感染的反應(yīng)。Shalek等人還把這項(xiàng)技術(shù)帶到南非，并分析了那里的TB和HIV感染患者的組織樣本。

Shalek說，“這樣一個(gè)簡(jiǎn)單的系統(tǒng)可以被攜帶到任何地方，這可以導(dǎo)致單細(xì)胞RNA測(cè)序技術(shù)的廣泛應(yīng)用。”

Love的實(shí)驗(yàn)室正在使用該方法分析食物過敏的人的免疫細(xì)胞，這可以幫助研究人員確定為什么一些人能夠更好地響應(yīng)過敏治療。Love說，“慢性疾病中還有很多未知數(shù)，這些類型的工具可幫助你獲得新的見解。”

此外，研究團(tuán)隊(duì)還與Dana-Farber/Harvard癌癥中心的臨床研究人員合作，將該技術(shù)應(yīng)用于發(fā)現(xiàn)新的免疫療法來治療癌癥。

參考文獻(xiàn)：

Seq-Well: portable, low-cost RNA sequencing of single cells at high throughput. Nature Methods (2017) doi:10.1038/nmeth.4179????

SeqWell 描述：

• 試劑盒包含制備文庫所需的主要試劑，包括Magwise™順磁珠（不包括DNA聚合酶）
• 一個(gè)96孔板輸入的文庫制備
• 在3-30 ng的寬輸入范圍內(nèi)對(duì)輸入DNA進(jìn)行歸一化
• 基于批量的定價(jià)（節(jié)省實(shí)驗(yàn)室總成本的30-50％）

推薦應(yīng)用：

• 合成構(gòu)建體測(cè)序（擴(kuò)增子，質(zhì)粒，BAC等）
• 微生物組篩選
• 微生物全基因組測(cè)序
• 單鏈RNA
• 低深度全基因組/ GBS

規(guī)格：

• 從96個(gè)樣本中準(zhǔn)備多重庫的時(shí)間：
  • 動(dòng)手時(shí)間：1小時(shí)
  • 總耗時(shí)：3小時(shí)
• 推薦輸入：每個(gè)樣品3-30 ng基因組DNA（n = 96）
• 預(yù)期成績(jī)：
  • 文庫產(chǎn)量：750 – 1500 fmoles的純化的多重文庫
  • 文庫多樣性：每個(gè)樣品每1M測(cè)序讀取的重復(fù)率<5％
  • 大量歸一化：所有96個(gè)樣品的讀數(shù)計(jì)數(shù)通常小于2.5倍（小到大）
• 與Illumina測(cè)序系統(tǒng)的兼容性：
  • 與Illumina公司MiSeq®，NextSeq®，HiSeq®和NovaSeq®儀器平臺(tái)兼容

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